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示蹤染料在凝膠電泳中起什么作用?



凝膠電泳是一種常用的實驗室技術,具有許多實際應用,包括DNA指紋圖譜和基因組測序。該過程涉及使用電流分離DNA片段,同時跟蹤通過過濾凝膠的分子運動速率。

在無色DNA樣品中添加藍色或橙色跟蹤染料,可以查看樣品并獲得有關DNA分子在電泳過程中如何運動的信息。鑒定是基于分子遷移后凝膠上DNA條帶的大小。

凝膠電泳的工作原理

凝膠電泳使用電流將DNA片段拉過凝膠,以通過大小和電荷分離和鑒定DNA分子。這種凝膠通常由瓊脂糖粉制成,瓊脂糖粉是從海藻中提取的多糖。

將瓊脂糖添加到水和鹽的緩沖溶液中,并將混合物加熱和冷卻以制成多孔凝膠,該凝膠將在電泳過程中充當過濾基質。然后將凝膠置于電泳儀中,并用導電的緩沖溶液覆蓋。

將含有DNA和負載染料的溶液吸移到凝膠中**在凝膠制備過程中制備的小孔中。染料可 幫助您 清楚地看到要添加到電泳單元負極附近的凝膠孔中的樣品。

正電極位于另一端。將已知的DNA片段標準品放置在**個孔中,該孔將創建一條DNA條帶,用于比較和鑒定。

DNA分子的磷酸骨架使DNA帶負電荷。因此,相反的分子會吸引,因此,DNA分子會被吸引到正極,并在通電時開始移動或“遷移”。

較小的DNA片段比較大的片段移動得更快,因為它們在通過凝膠的多孔基質遷移時遇到的阻力較小。大小相似的DNA片段在凝膠中形成DNA條帶。

加載染料的目的和重要性

DNA是無色的,因此在樣品中添加跟蹤染料有助于您確定電泳過程中凝膠中不同大小的蛋白質分子的移動速率。與DNA樣品一起移動的加載染料的例子包括溴酚 藍和二甲苯基氰醇。

選擇的染料不應具有反應性或改變DNA。溴酚藍是一種染料,用于追蹤包含約400個堿基對的較小尺寸的DNA鏈,而二甲苯基氰醇更適合于具有多達8000個堿基對的較大的DNA鏈。選擇的染料不應具有反應性或改變DNA。

甘油在瓊脂糖凝膠電泳中的作用

在準備進行電泳的DNA樣品時,您將需要添加甘油和水以及加載染料。甘油是一種濃稠的糖漿物質,在將DNA樣品插入凝膠板一端的孔中之前,會賦予DNA樣品更高的密度。

如果沒有甘油,DNA樣品就會分散,而不是像在形成DNA階梯時那樣沉入井中并形成一層。

SDS PAGE中的跟蹤染料

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)是一種適合分離蛋白質和氨基酸的技術,蛋白質和氨基酸比線性DNA分子更小且更復雜。使用聚丙烯酰胺(SDS PAGE凝膠)代替瓊脂糖凝膠進行電泳。

溴酚藍(BPB)作為跟蹤染料添加到樣品緩沖液中,該跟蹤染料沿分離蛋白質的相同方向移動并劃分其前緣。

DNA結合染料的作用

可以將DNA結合染料(例如橙色溴化乙錠)添加到凝膠或電泳緩沖液中。顧名思義,染料附著在DNA分子上。

 

處理這種誘變染料時**格外小心,因為它可以結合皮膚細胞中的DNA。與跟蹤染料不同,溴化乙錠在紫外光下發出明亮的熒光,使DNA條帶可見。


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