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什么是凝膠電泳?

電泳是實驗室中常用的一種技術,用于根據大小分離帶電分子,例如DNA。

  • 凝膠電泳是實驗室中常用的一種技術,用于分離帶電分子,例如DNA ?,RNA ?和蛋白質?根據它們的大小。
  • 當電流通過凝膠時,帶電分子穿過凝膠。
  • 在凝膠上施加電流,以使凝膠的一端帶正電荷,而另一端帶負電荷。
  • 帶電分子的運動稱為遷移。分子向相反電荷遷移。因此,帶負電荷的分子將被拉向正末端(相反的方向吸引!)。
  • 凝膠由可滲透的基質(有點像篩子)組成,當電流通過時,分子可以穿過該基質。
  • 較小的分子在凝膠中的遷移速度更快,因此比較大的分子遷移速度更慢,因此遷移距離更短,因此較大的分子可以遷移。結果,分子按大小分開。

凝膠電泳和DNA

  • 電泳使您能夠區分不同長度的DNA片段。
  • DNA帶負電,因此,當電流施加到凝膠上時,DNA會向帶正電的電極遷移。
  • 較短的DNA鏈比較長的DNA鏈穿過凝膠的速度更快,從而導致片段按大小順序排列。
  • 使用染料,發熒光?標簽還是放射性的?標記使分離后的凝膠上的DNA可見。它們將在凝膠上顯示為條帶。
  • 具有已知長度片段的DNA標記通常與樣品同時在凝膠中穿行。
  • 通過將DNA樣品的條帶與DNA標記的條帶進行比較,可以算出樣品中DNA片段的大致長度。

凝膠電泳如何進行?

準備凝膠

  • 瓊脂糖凝膠?通常用于可視化DNA片段。用于制作凝膠的瓊脂糖濃度取決于您正在使用的DNA片段的大小。
  • 瓊脂糖濃度越高,基質越致密,反之亦然。較小的DNA片段在較高濃度的瓊脂糖上分離,而較大的分子需要較低濃度的瓊脂糖。
  • 為了制備凝膠,將瓊脂糖粉與電泳緩沖液混合并加熱至高溫,直到所有瓊脂糖粉融化為止。
  • 然后將熔化的凝膠倒入凝膠澆鑄盤中,并在一端放置一個“梳子”,以制成用于移液的孔。
  • 凝膠冷卻并固化后(現在將是不透明而不是透明的),將梳子移開。
  • 現在,許多人都使用預制的凝膠。
  • 然后將凝膠放入電泳槽中,并將電泳緩沖液倒入槽中,直到覆蓋凝膠表面為止。緩沖器傳導電流。所用緩沖液的類型取決于樣品中DNA片段的大致大小。

準備用于電泳的DNA

  • 在電泳之前將染料添加到DNA樣品中,以增加樣品的粘度,這將防止其浮出孔,從而可以看到樣品通過凝膠的遷移。
  • 將DNA標記物(也稱為大小標準品或DNA階梯)裝入凝膠的**個孔中。標記中的片段長度已知,因此可用于幫助估計樣品中片段的大小。
  • 然后將制備的DNA樣品吸移到凝膠的其余孔中。
  • 完成此操作后,將蓋子放在電泳槽上,確保凝膠以及正負電極的方向正確(我們希望DNA跨凝膠遷移至正端)。

分離碎片

  • 然后打開電流,使帶負電荷的DNA穿過凝膠向凝膠的正側移動。
  • 較短長度的DNA移動的速度快于較長長度的DNA,因此在運行電流時移動的距離更遠。
  • DNA遷移到凝膠中的距離可以通過監視上樣緩沖液染料的遷移來直觀判斷。
  • 留下的電流要足夠長,以確保DNA片段在凝膠上移動的距離足以將它們分開,但不要過長以至于它們從凝膠末端流出。
用于按大小分離DNA片段的DNA電泳設備插圖。 凝膠位于緩沖罐中。 將DNA樣品置于凝膠一端的孔中,并且電流流過凝膠。 帶負電荷的DNA向正電極移動。 圖片來源:Genome Research Limited

用于按大小分離DNA片段的DNA電泳設備插圖。凝膠位于緩沖罐中。將DNA樣品置于凝膠一端的孔中,并且電流流過凝膠。帶負電荷的DNA向正電極移動。圖片來源:Genome Research Limited

可視化結果

  • 一旦DNA在凝膠上遷移足夠遠,就將電流切斷,并將凝膠從電泳槽中移出。
  • 為了使DNA可視化,用與DNA結合的熒光染料對凝膠進行染色,然后將其放在紫外透射儀上,該透射儀將被染色的DNA顯示為亮帶。
  • 或者,染料可以在倒入之前與凝膠混合。
  • 如果凝膠正確運行,將可見DNA標記物/大小標準品的條帶模式。
  • 然后可以通過想象一條橫穿DNA標記帶的水平線來判斷樣品中DNA的大小。然后,您可以通過將它們與標記中**接近的條帶進行匹配來估計樣品中DNA的大小。

顯示脫氧核糖核酸帶的例證在凝膠分離了。將DNA片段的長度與包含已知長度的片段的標記進行比較。


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