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電泳分離技術



電泳是帶電粒子在電場作用下的遷移。
帶正電的粒子向陰極遷移,帶負電的粒子向陽極遷移。它們的遷移速率取決于電場強度,粒子(即分子)的凈電荷,大小和形狀以及分子在其中移動的介質的離子強度,粘度和溫度。作為一種分析工具,電泳簡單,快速且靈敏度高。由于許多重要的生物分子(例如核酸和蛋白質)都具有可電離的基團,因此它們在任何給定的pH值下都帶有電荷。因此,電泳是生物化學和分子生物學中**廣泛使用的技術之一。


核酸由于其磷酸鹽主鏈而帶負電荷,因此會向陽極遷移。通過電泳分離核酸在支持基質或“凝膠”中進行,**常用的是瓊脂糖或聚丙烯酰胺。通常,將凝膠澆鑄成薄板狀,并帶有用于裝載樣品的孔。將凝膠浸入電泳緩沖液中,電泳緩沖液提供離子以承載電流,并提供某種類型的緩沖液以將pH維持在相對恒定的值。載體基質提供了按大小分離分子的方法,因為它們是多孔凝膠。多孔凝膠可以通過阻止或在某些情況下完全阻止大分子的移動,同時允許較小的分子自由遷移來充當篩子。

瓊脂糖是從海藻中提取的多糖。通常以0.5%至2%的濃度使用。瓊脂糖濃度越高,凝膠“就越硬”。瓊脂糖凝膠具有較大的分離范圍,但分離能力較低。通過改變瓊脂糖的濃度,可以使用標準電泳技術分離約200至50,000 bp的DNA片段。聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺的交聯聚合物。聚合物鏈的長度取決于所用丙烯酰胺的濃度,通常在3.5%至20%之間。聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍很小,但分離能力非常高。對于DNA,聚丙烯酰胺用于分離小于約500 bp的片段。但是,在適當的條件下,單個堿基對長度不同的DNA片段很容易分辨。與瓊脂糖相反,聚丙烯酰胺凝膠被廣泛用于分離和表征蛋白質混合物。

對于大多數DNA和RNA樣品,在瓊脂糖凝膠中進行電泳分離。由于磷酸鹽骨架,由于DNA或RNA的任何給定片段中每單位長度的電荷相同,因此所有樣品在施加電場的情況下都以相同的遷移率移向陽極。發生在瓊脂糖基質中的分離是因為它可以阻止核酸的移動。**大的分子穿過凝膠孔的困難**大,而**小的分子移動沒有太大困難。這樣,凝膠電泳期間核酸的遷移率將取決于大小,**小的分子移動**快。

凝膠電泳后,需要對凝膠中的核酸進行染色和可視化。**常用的染色劑是熒光染料溴化乙錠。該分子插入核酸分子,可以在紫外線下觀察。凝膠顯示對應于具有不同分子量的不同核酸分子群體的條帶。片段大小通常以“核苷酸”,“堿基對”或“ kb”(對于數千個堿基對)報告,具體取決于單鏈或雙鏈DNA是否已分離。通常通過與包含已知長度的線性DNA片段的市售DNA階梯進行比較來確定片段大小。

到目前為止,已經討論過的通過電泳分離的核酸處于天然狀態。在這種情況下的電泳條件稱為非變性。當要確定DNA序列或要確定RNA大小時,使用變性條件。DNA測序凝膠在變性劑(例如尿素和甲酰胺)的存在下運行,并且由于所分析的DNA分子較短,因此使用丙烯酰胺凝膠代替瓊脂糖。通過凝膠電泳確定RNA的大小需要用變性劑例如甲醛,乙二醛和甲基汞氫氧化物使RNA變性。

為了鑒定凝膠中特定核苷酸序列的存在,使用了一種稱為Southern印跡(如果正在分析DNA)或Northern印跡(正在分析RNA)的技術。在這兩種情況下,來自完整凝膠的DNA或RNA都將轉移到一塊硝酸纖維素膜或尼龍膜上。然后將膜暴露于雜交探針,即具有特定序列的單個DNA片段,要確定其在靶DNA(或RNA)中的存在。對探針DNA進行標記,以便通常可以通過引入放射性或用熒光或發色染料標記分子來對其進行檢測。
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