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如何提高RNA提取物的質量和數量

分離RNA時,良好的實驗室技術**關重要。與固定和神圣的DNA相比,RNA更不穩定。具有核糖糖骨架的RNA含有高反應性羥基(C-OH)基團,確保鏈不斷制造,分解和重復使用。分離的RNA迅速降解,很容易被抗性酶核糖核酸酶(RNases)污染,這些核糖核酸酶隨處可見。

在本期Bench Bench中,我們采訪了舊金山加州科學院鳥類學和哺乳動物學系主任兼策展人Jack Dumbacher博士,了解他的實驗室目前的工作,即分離轉錄組和小RNA以鑒定宏基因組學病毒序列。與病毒作為病原體的典型觀點相反,病毒也可能與宿主具有共生關系或共生關系。了解鳥類中的這些進化關系是Dumbacher的研究目標之一。

“通常情況下,病毒顆粒是低豐度的RNA,”Dumbacher說。“核糖體RNA(rRNA)可能是你**初選擇的很大一部分。為了獲得良好的恢復,我們嘗試通過在田間采集大樣本并盡可能小心地保存它們來提高RNA產量。“

優化RNA保存

學院的收集探險通常發生在以生物多樣性而聞名的偏遠地區,如熱帶森林或珊瑚礁。Dumbacher團隊面臨的一大挑戰是,由于缺乏冷藏,無法用液氮快速冷凍樣品。(RNA在乙醇中穩定降解,這是DNA樣品的常見防腐劑。)而是從鳥的泄殖腔(后消化道開口)擦拭樣品,放入RNA穩定劑或含有4 M濃度的硫氰酸胍(GITC)緩沖液的其他混合物中。由于鹽含量,使用一些RNA穩定劑可能難以在液體樣品中進行RNA分離。保持冷藏鏈不是問題,

確保良好的分離

傳統上,GITC緩沖液已被用于裂解RNA提取中的細胞和病毒顆粒,并通過暫時使RNA變性來同時防止RNase酶活性。在這種情況下,**在裂解前進行一些完整的病毒分離樣過濾,以避免核酸湯。Dumbacher團隊收集的樣品主要是液體形式 - 需要很少的均質化,但良好的分離很重要。在現場,該團隊使用0.2μ過濾器 - 類似于旋轉柱中的過濾器 - 來過濾較小的病毒顆粒。像完整細胞一樣留下較大的顆粒。其他實驗室使用冷凍組織樣本,**快速徹底地均質化以獲得良好的恢復。無論選擇何種方法,都會保留一定量的基因組(gDNA)。

盡量減少RNase暴露

在實驗室中,消除內源和外源RNase與純化RNA之間的接觸始終是一個問題。在RNA純化過程的早期,RNase的外部來源不那么具有威脅性。但是,在RNA制劑不再受GITC溶液等變性劑的保護后,RNA被純化后,您需要避免激活RNases。蛋白質RNase抑制劑可以隔離剩余的RNase,適用于大多數應用,特別是那些含有內源性RNase的應用。作為預防措施,每當觸摸設備時 - 應更換玻璃器皿或移液器 - 手套。(用于RNA純化的玻璃器皿和器具的推薦培養時間在180°C**200°C時**少為4小時。)學院的比較基因組學實驗室盡可能使用DEPC處理過的水代替分子級水。DEPC水通過堿基的組氨酸修飾使RNase失活。當在室內制造水時,建議事先對DEPC水進行高壓滅菌,以降解DEPC。

增加RNA產量

如果您尚未指定提取,請開始跟蹤。RNA產量因不同組織和樣品而有很大差異。對于Dumbacher,收集的每個樣品通常RNA含量都很低。獲得的RNA量取決于鳥類**后吃的時間,吃的東西,以及其他化學物質或細菌是否在起作用。“即使我們使用RNA含量非常低的樣本,當你構建你的庫時,它會非常令人印象深刻,你會看到你在另一端獲得了多少序列,”Dumbacher說。(他的小組目前正在使用新一代測序技術來分離病毒序列。)

為了增加(先前RNA強健的)組織樣品中的RNA產量,避免過度均質化或加熱。以30秒的休息間隔以30秒的脈沖均質化可以改善RNA回收。此外,使用二氧化硅旋轉過濾器時,用更多的水洗脫會從膜中釋放出更多的RNA。無論您的實驗室使用何種下游技術,成功的分析都依賴于良好的RNA分離技術。實踐是**的。快樂解壓!

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