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優化Western Blotting的技巧

蛋白質印跡不是一門**的科學,特別是在方法論意義上,直接獲得**的,出版物就緒的結果并不是常態。但是,您可以采取一些步驟來優化Western印跡實驗,并確保它們能夠以**佳方式開始。這種微調過程稱為優化,Western印跡方案的幾個階段可以從中受益。

1. SDS-PAGE

您的蛋白質印跡實驗早在您獲得膜之前就開始了。你可以追溯到樣品制備,但為了空間的利益,讓我們從樣品分離開始。通過這個,你可以得到你放入的東西 - 如果沒有一個好的凝膠,你將無法得到一個好的膜,它將從那里向下螺旋。如果你自己涂上凝膠,要特別注意確保化妝的均勻性。選擇正確的丙烯酰胺百分比(參見Proteintech的  Western blot協議 [PDF])。通過抵抗在高電壓下運行凝膠的誘惑并使用等效體積的1x樣品緩沖液填充空孔,避免染色前“微笑”效應。

**重要的是,加入均勻量的蛋白質; 通過測定確定蛋白質濃度,并準備減少您的裝載量,如果您獲得“條紋”印跡。Proteintech驗證實驗室發現,每個泳道30μg蛋白質通常會產生無條紋和良好分離的條帶。

2.膜

您的膜選擇可以對Western印跡實驗的結果產生巨大影響。主要的兩種膜類型是PVDF和硝酸纖維素,但現在消費品市場上有幾種版本,包括例如針對基于熒光的**檢測優化的膜或低分子量蛋白質。

PVDF因其韌性,穩定性和對大多數酸和堿的耐受性而受到重視(這意味著它是那些希望剝離和重新探測印跡的人的**膜)。PVDF膜還提供比硝酸纖維素更好的蛋白質保留。

硝酸纖維素膜易于堵塞,通常可提供高信噪比。但是,你將無法剝離和重新探測它們。并注意硝酸纖維素膜的孔徑。

**后,關于實驗室傳統的一句話:不要害怕因實驗室規范而改變膜類型。嘗試不同的東西可能是**蛋白質印跡的**。

3.抗體濃度

假設您已經付出了所需的努力來  選擇您的抗體(Proteintech也提供了指南),您的下一步應該是確定**佳的工作抗體濃度。

抗體與抗原之間的結合速率(親和常數)受其在溶液中的相對濃度(以及其他變量,如溫度和pH)的影響。抗原豐度通常在Western印跡中固定,因此您通常需要調整抗體濃度以獲得更好的印跡。以有組織的方式進行此操作 - 測試幾種稀釋的抗體,同時保持所有其他參數不變 - 將幫助您確定實驗的**佳抗體濃度。

此步驟稱為抗體滴定,應在每次使用新抗體或一組實驗條件時進行。如果您注意到新批次的多克隆抗體與**后一批抗體的表現不同,也應該這樣做。

如何滴定抗體

許多公司在其抗體數據表中提供了推薦的稀釋度,這些通常是很好的球場數據,可以幫助您入門; 然而,仍然建議滴定抗體,因為用于獲得推薦稀釋度的條件可能與您自己的非常不同。如果產品數據表建議使用1:1000的稀釋度,請嘗試1:250,1:500,1:1000,1:2000和1:4000的系列。

一般情況下,如果您將推薦的稀釋液加上推薦稀釋液的兩倍和一半稀釋液(另一側稀釋液稀釋液),您將處于正確的軌道上。如果沒有推薦的稀釋液開始,請嘗試1μg/ ml的純化抗體作為起點。請記住保持所有其他協議參數相同,例如樣品類型,孵育時間,洗滌時間和溫度。

關于二抗的說明

也許你**嘗試不同濃度的二抗 - 特別是在化學發光檢測的情況下。HRP標記的第二抗體的濃度直接影響條帶的外觀。HRP酶太少會導致化學發光信號低,光譜或光譜缺失。另一方面,過高的濃度會產生“燒壞”的條帶。這是由于襯底的快速耗盡導致中間沒有信號的帶。化學發光試劑孵育的長度也會有所不同(參見下面的#6,檢測)。

4.阻塞條件

可以使用各種阻塞緩沖區,這些緩沖區都不適用于所有情況。為每個抗體 - 抗原對嘗試幾種阻斷緩沖液是很重要的。請記住,基于乳汁的阻斷緩沖液含有內源性生物素,糖蛋白和可能干擾信號的酶。例如,含乳的緩沖液含有活性磷酸酶,會破壞您對磷酸化蛋白質的檢測; 在這些情況下,嘗試替代品,如牛血清白蛋白基阻滯劑。

5.洗滌

在大多數情況下,每當我有高背景信號時,修改下一次貫穿的洗滌步驟已被證明是有用的。通常,我通過將吐溫-20濃度從0.05%增加到0.1%來實現這一點。您還可以使用以下任何一種策略來改變洗滌強度:增加洗滌時間和體積,執行額外的緩沖液更換或使用更強的洗滌劑(例如,SDS代替吐溫20)。

6.檢測

檢測階段對于獲得良好的Western印跡信號是不可或缺的。有許多化學發光試劑和化學發光替代品,如熒光檢測 - 所以如果你目前的檢測方法不符合實驗室標準,有很多選擇。例如,您可以選擇具有更高靈敏度的試劑或產生更持久信號的試劑。后一種選擇將不可估量地增加印跡的再現性。

在更簡單的水平上,化學發光檢測可以通過膠片曝光時間進行優化。這可能是**常執行的優化步驟,因為它快速而簡單。始終將您的墨水暴露在一系列單獨的時間點(但請記住,大約10到15分鐘后,所有HRP底物將用完)。你的電影選擇也會有所作為。我總是發現專門用于化學發光檢測的膠片 - 而不是任何標準的放射敏感膠片 - 是**佳選擇。

雖然熒光成像系統可能尚未供每個實驗室使用,但您所在機構可能會提供核心或中心設施來提供此技術。基于熒光的檢測系統的直接優勢是它們能夠同時檢測多種抗體,無需剝離和重新探測您的印跡。

或者,您可以完全跳過一級抗體的二次檢測,并簡化您的Western印跡方案,使用HRP結合的一抗識別常見的上樣對照和蛋白標簽。(以下列出的相關產品均以此格式提供。)

優化的主要目的是增加特定波段的信噪比并減少非特定波段(如果存在)。不可否認,如果您選擇優化上述所有變量,則需要花費大量時間; 然而,即使是一兩次改動也可能有所不同,從長遠來看實際上可以省時間。總的來說,我認為優化是一項非常有價值的工作 - 如果你想獲得出版品質的西方印跡,那么這是一項必要的策略。

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