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雙向電泳常見問題解答

隨著人類基因組草圖完成,蛋白質組研究全面展開。作為經典蛋白質組學分離技術,雙向電泳越來越被科研人員所熟知。但要想得到漂亮的雙向電泳譜圖,卻并不那么容易。我們將針對雙向電泳過程中常出現的問題進行總結,希望能給您的實驗帶來幫助。
 
本期我們重點關注雙向電泳圖譜中常出現的水平條紋。雙向電泳水平條紋的產生主要來自于樣品本身和一向等電聚焦電泳,下面就從這兩方面的原因及其解決辦法進行詳述。
 
一、樣品制備問題
 
1.樣品中存在影響等電聚焦的雜質
蛋白樣品中任何離子凈電荷的污染都將影響等電聚焦,并引起水平條紋。嚴重的污染物干擾,我們在等電聚焦過程中可以觀察到:低電壓運行時,軟件和儀器監測到的電流很快就達到50 µA的限定,預設的高電壓不能達到;嚴重時可能導致電弧產生或IPG膠條燃燒。常見的污染包括樣品制備過程中引入的鹽和其他帶電小分子、去污劑;以及樣品本身內源性的雜質,包括各種內源性的帶電小分子,核酸、多糖、脂類、酚類等非蛋白雜質。了解樣品中主要污染物的組成,并且在樣品制備過程中采取有針對性的辦法去除污染物即可改善水平條紋。
 
鹽和帶電小分子:水化上樣將鹽離子濃度降低到10 mM以下,而杯上樣則限制樣品鹽濃度不超過50 mM。脫鹽常用脫鹽柱、旋轉透析或透析袋;而用TCA和丙酮沉淀再重懸,是一個更有效的脫鹽方法,但往往TCA清除不盡,蛋白復溶效率不高。2-D Clean-Up Kit (貨號80-6484-51)則采用**的共沉淀劑和洗滌附加物,可以定量沉淀各種來源的蛋白質,蛋白復溶率通常大于90%。使用2-D Clean-Up Kit不會造成斑點增加或減少,或斑點位置的變化,操作簡單,整個過程可以在一個小時內完成。另外,使用劣質水、尿素或其他試劑也會造成導電性升高;尿素還易分解為帶電的產物。選用**試劑,重要的試劑包括尿素、硫脲、DTT、去污劑、載體兩性電解質、水等,防止一向等電聚焦所需的這些試劑因本身純度不夠,而引入帶電雜質。即使選擇了**尿素、硫脲,保存得當也非常**。尿素、硫脲吸水后會發生離子化,影響等電聚焦。樣品中鹽離子濃度還可以通過改變IEF的程序來降低。先設一步或幾步低壓程序,如100V 3h,100v---1000v gradient 3h,然后再升高電壓完成IEF,這個低壓程序可以使樣品中的離子**先遷移到IPG膠條的末端,降低電內滲,減少水平條紋的形成。
 
帶電荷的去污劑:**常用的離子型去污劑如SDS,能夠包被蛋白,并徹底改變它們的凈電荷,**終影響它們的等電點,導致條紋出現以及IPG膠條中樣品的損失。如果在樣品中存在SDS,那么其用溶脹液稀釋后的**終濃度不能超過0.25%。或者,添加其他非離子型去污劑或兼性離子去污劑稀釋 SDS的濃度。
 
核酸:樣品的核酸污染也會導致水平條紋的出現。高分子量的核酸還會堵塞膠孔,阻礙聚焦。許多蛋白與核酸結合,產生了蛋白-核酸的混合物,每個都有著不同的等電點。在等電聚焦之前用核酸酶(貨號80-6501-42)處理樣品,可去除樣品中的核酸。或者在樣品制備時超聲剪切核酸,也可在精胺存在時通過超速離心也可去除核酸。
 
多糖:唾液酸、帶負電荷的多糖也能產生與核酸類似的水平條紋。不帶電荷的多糖通過阻塞凝膠孔,阻礙樣品進入IPG膠條,導致條紋出現。去除多糖用TCA/acetone (Damerval et al. 1986),或者醋酸銨(甲醇飽和硫酸銨)沉淀然后用苯酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)。
 
2. 蛋白被修飾——氨基甲酰化

為了防止蛋白質的修飾,不要在加入尿素后加熱樣本。如果樣本中存在尿素,溶液溫度不能超過37°C。溫度上升會使尿素水解為異氰酸酯,異氰酸酯能通過氨基甲酰化作用(carbamylation)對蛋白質進行修飾,使個別蛋白產生電荷異質性,造成人為的“斑點串(charge trains)”。蛋白樣品應當使用高純度尿素制備,切勿加熱**30°C以上。
 
3.二硫鍵形成

二硫鍵形成也是樣品制備方面導致水平條紋的一個重要原因。在雙向電泳之前,若蛋白樣品中存在二硫鍵,則它們是隨機存在于分子內部或分子之間的。二硫鍵形成產生了多種蛋白構象,包括較小的pI變體(在雙向凝膠上顯示為單個蛋白點的變寬)以及同一蛋白的多聚物(以點、幻影點、缺失點的條紋尾和拖尾出現)。防止二硫鍵的形成能避免這些問題。二硫鍵問題在兩種情況下特別嚴重:1)堿性蛋白的分析,2)較長IPG膠條的使用。樣品制備過程中加還原劑,如DTT,可打開二硫鍵,需要注意的是DTT在IEF過程中會遷移而使蛋白發生再氧化。對于堿性蛋白,采用DeStreak去拖尾試劑(貨號17-6003-18)和DeStreak去拖尾水化液,可將蛋白質巰基團轉變為穩定的二硫化物基團,防止發生非特異性氧化反應。結合在酸性端杯上樣可有效減少堿性蛋白聚焦過程中產生的水平條紋。
 
4.蛋白溶解度差

未能徹底溶解樣品中的所有蛋白將引起水平條紋。雙向電泳**常用的樣品緩沖液中主要組分是尿素、非離子去污劑(如NP-40)或兼性離子去污劑(如CHAPS)及還原劑(如DTT)。此混合物中包含的其他組分,如硫脲或新型去污劑,如氨基硫代甜菜堿家族(如ASB-14)能改善膜蛋白的溶解性。這些試劑的綜合作用是通過更好地溶解蛋白的疏水區域以減少因蛋白中的氫鍵或與IPG凝膠基質的相互作用而產生的聚集。另外,在等電聚焦前通過離心去除不溶蛋白也是一種好的做法,能防止它們干擾其他蛋白進入凝膠基質。
 
二、等電聚焦問題
 
1.上樣量太高或存在高豐度蛋白

IPG膠條的載樣量通常取決于膠條的長度、pH范圍以及所使用的染色方法。下表列舉了各種不同膠條推薦的上樣量。高豐度蛋白存在的樣品需要更多考慮。人血清中的白蛋白占蛋白質總量的70~90%,IgG占10~25%。利用白蛋白和IgG去除試劑盒(貨號28-9480-20和28-9466-03)可選擇性地與人白蛋白和IgG結合并去除,從而改善低豐度蛋白質的分辨率,增加樣本的斑點數量。另外,使用杯上樣的方法上樣時,上樣量過大,可能會導致高豐度蛋白過載,從而使蛋白聚集。這會導致某一蛋白在等電點(pI沉降)沉淀,并引起水平條紋。因此,杯上樣時需要限制蛋白濃度不超過10mg/ml。
 
表. IPG膠條推薦載樣量
膠條長度
(pH)
推薦上樣量(µg)
銀染
考染
7
3-11NL, 3-10NL, 3-10
3-6
30-60
 
4-7
4-8
25-150
 
3-5.6NL, 6-11, 7-11NL
8-16
40-240
13
3-11NL, 3-10NL, 3-10
10-20
50-240
 
4-7
15-30
75-450
 
3-5.6NL, 6-11, 7-11NL
30-60
150-900
18
3-11NL, 3-10NL, 3-10
20-40
100-500
 
4-7
30-60
150-900
 
3-7NL, 6-9, 6-11
60-120
300-1500
24
3-11NL, 3-10NL, 3-10
30-60
200-600
 
4-7
45-90
200-1300
 
3-5.6NL, 3-7NL, 6-9, 7-11NL
80-170
400-2000
 
2.聚焦不足
不完全聚焦也會引起水平條紋。確保總的伏特小時數適用于所使用IPG膠條的長度和pH范圍,并根據上樣量進行調節。因此,不同長度和pH范圍的膠條不能同時電泳。另外,等電聚焦程序設置了總電流的限制-50uA/膠條,多根膠條同時聚焦時,如果某個樣品離子較多,它將承載大部分電流,減慢了其他蛋白樣品的聚焦。這導致不完全聚焦和水平條紋的出現。因此,電導率相差很大的樣品應當單獨運行IEF。
 
3.聚焦過度

延長聚焦時間不一定能提高分辨率。實際上,它可能引起水平條紋。一些蛋白樣品更易聚焦,因此**對每個樣品類型及每種緩沖液獨立開展伏特小時數的優化,以確定穩態的IEF模式。
 
總之,樣品制備和等電聚焦是雙向電泳譜圖出現水平條紋的**主要的原因。除此之外,如果平衡緩沖液或覆蓋膠條的瓊脂糖中存在雜質,也可能使整個膠上出現橫條。這就需要配制新鮮干凈的瓊脂糖和平衡緩沖液。并且,IPG干膠條的水化也非常**,通常水化時間要在10h以上。保證整個膠條均勻、充分溶脹也是去除水平條紋必需的。
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